fNIRS无创监测绵羊脑功能和情绪的可靠性

摘要

这项工作的目的是批判性地评估功能性近红外光谱（fNIRS）是否可以作为无创记录绵羊大脑功能和情绪的工具。我们考虑了一种实验设计，包括仪器（定制的无线多距离fNIRS系统）、更精确的物理建模（光子扩散的两层模型和3D蒙特卡罗模拟）、神经解剖工具的支持（通过相同动物的MRI和DTI数据定位fNIRS探针）、，以及测试自由运动绵羊行为反应的严格协议（运动任务、惊人测试）。在运动任务和惊人测试中，几乎没有发现大脑外区域的血流动力学反应。在运动任务中，正如预期的那样，我们发现绵羊行走时大脑区域出现了典型的血流动力学反应。在这项令人震惊的测试中，测得的大脑区域血流动力学反应主要来自运动。总的来说，这些结果表明，利用当前的设置和探针定位，我们主要是测量绵羊大脑的运动区域，而不是探测与情绪处理相关的太深的皮层区域。

介绍

对待动物的方式对动物和人都很重要。对动物福利的关注源于人们认识到动物是有知觉的生物，寻找动物情绪和认知过程的无创指标是从神经科学到动物福利等学科的一个重要目标。然而，家养食草动物行为的神经生理基础，饲养用于肉类、牛奶或羊毛生产，在很大程度上仍然是未知的。绵羊可以作为一个有效的模型，用于执行各种复杂的任务和行为，包括目标导向的运动协调、情绪、面部识别和基于记忆的表现1、2、3、4。此外，在转化实验神经科学中，绵羊的回旋脑可以被视为啮齿类动物的替代物1.5。由于认知过程或情绪状态通常可以反映在大脑反应6中，因此更好地理解绵羊在各种环境中的情绪状态或对不同刺激的反应将有利于神经科学和动物福利。

了解动物大脑中的认知过程和情绪状态是如何表达的仍然是一个挑战，尤其是以非侵入性的方式。此前，已在动物大脑的功能成像中使用了几种成功用于人脑标测的方法，包括功能磁共振成像（fMRI）7、8、9、10、11、12、13、14、脑电图和感觉诱发电位15、16、17、18、19。虽然在人类研究中，任务和刺激可以呈现给清醒和协作的对象，但大多数测量技术要求动物处于麻醉状态。因此，它的大脑反应会受到强烈影响。

功能近红外光谱（fNIRS）是一种新的技术，它利用近红外光非侵入性地测量人类大脑组织中氧合血红蛋白[O2Hb]和脱氧血红蛋白[HB]的浓度，或典型地测量它们相对于基线时期[ΔO2Hb]和[ΔHHb]的变化。与fMRI一样，fNIRS依赖于神经血管耦合机制20，以及近红外光深度穿透生物组织的能力21。fNIRS具有非侵入性、安全性、便携性和对运动伪影的敏感性低的特点，已广泛成功地应用于人类研究22。最常用的fNIRS方法是使用稳态光源和检测器21的连续波fNIRS（CW fNIRS）。由于CW fNIRS系统可以无线和小型化，因此也在自由移动的家畜中进行了一些应用，例如山羊23、狗24和绵羊25、26、27、28、29。在这些研究中，fNIRS监测被认为是一种额外的技术，用于测量暴露于不同刺激或不同环境的动物的情绪和认知反应。值得注意的是，研究结果有时不一致，6，30，这表明需要提高测量精度和可靠性。

事实上，以前所有关于农场动物的研究23、24、25、26、27、28、29都采用了一种专为人类新生儿而设计的fNIRS系统，但未针对特定物种的动物分析学31进行优化。特别是，它们都使用了固定的源配置此外，与通常在人类fNIRS研究中所做的不同，在fNIRS中，探头的放置可以通过适当的神经解剖图像和功能图谱33、34、35来指导，探头在动物头部的放置没有磁共振成像（MRI）数据的帮助，而且很少有动物大脑的神经解剖或功能图谱25的支持。因此，fNIRS信号被归因于额叶或前额叶区域，也假设了大脑皮层中的血管盗窃机制23、26、27、28，但没有确定该技术对特定皮层区域的敏感性。

此外，用于fNIRS数据分析的方法可能缺乏准确性。事实上，头皮中发生的表面血流动力学事件可能会干扰皮层的血流动力学变化，除非采用适当的几何方法来模拟动物头部。

最后，fNIRS数据处理利用了从文献中获取的关于差分路径长度因子（DPF）的先验信息，并从单个死亡动物中获得36。为了提高fNIRS数据分析的准确性，DPF实际上用于通过改进的比尔-朗伯定律或类似的基于模型的方法21从测量的强度变化中导出血红蛋白变化。错误的DPF数据可能导致对血红蛋白浓度的不准确估计。

从上述观察结果可以看出，fNIRS技术仍然是一种创新的、未经充分验证的方法，用于研究家畜的皮层活动。这项工作的目的是提高绵羊fNIRS测量的可靠性和准确性，并批判性地评估fNIRS是否可以作为无创记录该物种大脑功能和情绪的工具。为此，我们考虑了一种实验设计，该设计包括仪器（定制的无线多距离fNIRS系统）、更精确的物理建模（光子扩散的两层模型和3D蒙特卡罗模拟）、神经解剖工具的支持（通过相同动物的MRI和DTI数据定位fNIRS探针）、，以及测试自由运动绵羊行为反应的严格协议（运动任务、惊人测试）。

后果

运动任务期间的血流动力学变化

在执行运动任务的13只绵羊中，有两只绵羊因频繁的头部抖动而被排除在分析之外，如视频记录评估所示（有关行为图的详细信息，请参见补充表ST2）。在剩下的11只羊中，我们计算了左右半球的组平均值[ΔO2Hb]和[ΔHHb]（图1，下排）。两个半球的组平均值显示了典型的血流动力学反应，在运动期间脑组织中[ΔO2Hb]增加，[ΔHHb]非对称性降低（p < 0.005）。在脑外组织中几乎没有观察到血流动力学变化（图1顶行）。

图1

图1

[ΔO2Hb]（红线）和[ΔHHb]（蓝线）的组平均值，单位为μM，以及大脑外（上）组织（上排）和大脑（下）组织（下排）以及左（左列）和右（右列）半球在运动任务期间的标准差。在每个地块中，前5秒是基线（绵羊静止），随后是30秒的步行（标记为灰色区域），最后是5秒的恢复期（绵羊静止不动）。每个子图形中的水平黑线表示零值。

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椋鸟试验期间的血流动力学变化

13只羊接受了令人震惊的测试，其中3只羊由于在测试过程中的行为而被排除在外：两只羊表现出频繁的头部抖动；其中一人在雨伞打开后没有飞行反应或结冰。在剩下的10只羊中，如果动物在咀嚼或摇头，我们也排除了阻塞。因此，我们保留了约80%的记录块（共39个），然后对其进行平均以获得组平均值[ΔO2Hb]和[ΔHHb]。在整个测试过程中，大脑外组织几乎没有血流动力学变化，如图2所示，顶行。在两个半球中，在惊吓刺激后，大脑组织显示出[O2Hb]的短暂增加（如图2，底部一行所示）。此外，右半球还显示出一种短暂的经典大脑激活模式，[O2Hb]增加，[HB]减少。

图2:

图2:

[ΔO2Hb]（红线）和[ΔHHb]（蓝线）的组平均值（单位：μM），以及在大脑外（上）组织（上排）和大脑（下）组织（下排）以及左（左列）和右（右列）半球的惊人测试中的标准差。在每个子图中，前5秒是基线，随后是3秒的惊吓刺激（标记为灰色区域），最后是60秒的恐惧反应。每个子图中的水平黑线表示零值。

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对动物行为的分析揭示了对惊吓刺激的两种不同反应：在10只羊的28个街区中观察到飞行反应，而在8只羊的11个街区中观测到冰冻反应。因此，我们计算了两组（标记为移动组和站立组）的组平均值[ΔO2Hb]和[ΔHHb]。

两组大脑外组织几乎没有血流动力学反应（图3顶行，图4顶行）。在脑组织中，对于Move组（图3底部一行），我们在左半球和右半球都有典型的血流动力学反应（即[O2Hb]增加和[HHb]减少）。我们还注意到，在典型反应之前，在伞打开期间，左半球大脑组织中的氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白都增加了（见图3底部行中的灰色区域）。

图3

图3

与图2相同，但移动组的组平均值（绵羊在3秒的惊人刺激期间和之后移动）。

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图4

图4

与图2相同，但站立组的组平均值（绵羊在3秒的惊人刺激期间和之后仍在）。

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相反，对于Stand组，两个半球的血流动力学变化模式不太清楚且不同。在左半球，我们看到[O2Hb]和[HHb]快速增加，随后[O2Hb]缓慢衰减到小于基线的值，而对于[HHb]，我们观察到返回到基线值，有一个小的下冲（见图4，左下图）。在【O2Hb】和【HHb】初始下降后的右半球，我们注意到【HHb’回归基线，【O2Hb】出现不规则振荡，导致值低于基线（见图4，右下面板）。

讨论

这项研究通过使用可穿戴的CW fNIRS系统研究了自由运动的绵羊的大脑活动，该系统应用于执行运动任务的动物，并进行了惊人的测试。在这里，我们描述了一种实验设计，其中包括仪器的进步、更精确的物理建模和评估动物行为反应的严格协议，目的是改进应用于家畜的fNIRS方法。

首先，我们采用了定制的多距离无线CW fNIRS系统，该系统具有可自由调整的源和检测器位置。使用的短和长源探测器距离为ρ = 10 mm和ρ = 分别为30mm。尽管受动物头部的大小和解剖特征的限制，但这种配置既允许由于长距离（比之前的研究更长）而增强羊头部的光子穿透深度，也允许由于短距离的减少而更好地区分大脑外和大脑内的贡献。ρ处光子穿透深度的研究 = 10 mm和ρ = 在补充部分S3中报告了简化（均质板）和真实（MRI数据的3D网格）几何形状中的30mm，以帮助读者了解不同距离处光子穿透的不同特征。

我们随后通过相同动物的MRI数据指导fNIRS探针的定位，因为没有萨达羊的神经解剖和功能图谱（本研究中使用）。我们还通过动物大脑的扩散张量成像（DTI）MRI检查了信号的功能来源。根据MRI和DTI数据，我们确认fNIRS探针的位置位于皮层的运动区域上方（见补充章节S1）。

此外，我们通过采用最先进的多波长时间分辨漫反射光谱系统，无创地测量了所有动物头部的光学特性（吸收系数和降低的散射系数）（见补充部分S2）。在几个波长下获取了飞行时间（DTOF）的光子分布，并将其拟合到光子扩散模型中。然后使用光学特性的数据来改进基于模型的数据分析。根据DTOF，我们还计算了活羊的DPF，因此为该参数提供了全新的数据（见补充表ST1）。就我们目前所知，文献中仅引用了从单个动物获得的死后DPF数据36。由于动物生产科学中的遗传选择和繁殖程序，动物与动物之间的高度一致性，我们的DPF数据有助于提高对绵羊进行的其他fNIRS研究的分析21的准确性37，38。

最后，为了改进大脑皮层血流动力学反应的估计，我们引入了一种基于模型的方法，对来自短距离和长距离的fNIRS信号进行数据分析，并通过模拟进行了验证（如补充章节S4所述）。该模型采用了两层几何结构，以更好地模拟绵羊头部的脑外和脑内组织层，旨在推进之前的方法