所有先前描述的活动对于设计一种实验测试都是有用的，该实验测试能够在行为任务期间无创地估计自由运动的绵羊的脑血流动力学。选择运动任务和令人震惊的测试作为选举评估，因为（a）我们想要一个简单的测试（运动任务）作为我们方法方法的验证；（b）这项惊人的测试可以让我们深入了解监测绵羊情绪和认知反应的可能性。

在fNIRS记录之前，绵羊接受了一段训练期，以尽量减少可能与任务绩效和行为反应相关的压力，这些可能会影响fNIRS数据采集的质量39。特别是，这些羊习惯于被分成同一群的小动物，由人类处理，并佩戴假fNIRS装置（包括帽子、电缆和胸带）。然后，他们接受训练，根据声音提示行走和停止。

运动任务的结果令人鼓舞，因为观察到了典型的血流动力学反应，位于fNIRS探针正下方的皮层中O2Hb增加，HHb减少，而非神经组织（包括皮肤、皮下层、骨骼和硬脑膜）没有明显的贡献。根据对人类受试者进行的fNIRS实验结果，其中发现运动任务和行走实验的血流动力学反应相似40，41，我们可以得出结论，具有所建议设置的fNISS技术能够监测与绵羊执行运动任务相关的皮质反应。

在令人吃惊的测试中，我们发现，当在令人震惊的刺激（飞行反应）过程中移动时，绵羊在实际刺激后表现出短暂的大脑激活（即血流动力学反应增强）。然而，当绵羊处于冰冻状态，因此在惊吓刺激后保持静止时，两个半球的反应都很小，只显示出[O2Hb]的有限下降。尽管表现出冻结反应的羊块数量有限，但这些结果表明，惊吓刺激后观察到的大脑反应很可能来自运动，而不是惊吓本身，如图3和图4所示。

这些结果得益于对大脑外和大脑组织层的同时研究，这有助于识别发生时的经典神经激活。

本研究中获得的绵羊神经成像数据（见补充章节S1）表明，在我们的实验设置中，fNIRS传感器位于绵羊运动皮层上方，并记录了与布罗德曼4区相关的血管动力学（关于绵羊运动皮层位置和连接的扩展讨论和参考，参见参考文献42），这项令人震惊的测试和运动任务的结果进一步表明，我们主要是在测量绵羊大脑的运动区域，而不是探测位于太深位置的眶上回“前额叶”皮层或与情绪处理相关的其他皮层区域。事实上，DTI MRI数据还证实，源自fNIRS探针下皮质区域的纤维束属于锥体和锥体外运动控制通路，它们投射到脑干中运动方案的发生器或脊髓，无论是同侧还是（大部分）相反侧42）。

受动物头部尺寸的限制，fNIRS探头的定位以及fNIRS装置的基本特性（例如波长范围、光功率）与先前发表的工作23、26、27、28相似。与其他研究不同，由于使用了适当的短距离和长距离通道，我们能够清楚地区分大脑外组织和大脑组织的贡献。我们的经验表明，文献6、30中报道的动物情绪和认知反应的fNIRS结果不一致且相互冲突，这可以通过这样一个事实来解释，即光子不太可能到达绵羊相当于人类前额叶皮层和其他专门处理认知刺激的区域，以及动物颅骨中紧接在其下方的呼吸窦（参见补充部分S1和补充部分S3）。

尽管我们仔细评估了先前实验工作的所有潜在混杂因素，但我们也意识到，仍存在一些可能影响本研究结果的局限性。

fNIRS探针位置的选择取决于绵羊头部的解剖结构。头骨的自然弯曲使得传感器只能定位在头部的顶部，并防止使用更大的源探测器距离（ρ > 30毫米）。此外，更短的源探测器距离（ρ < 10mm）可能有助于更好地辨别额外-此外，更短的源探测器距离（ρ < 10mm）可能有助于更好地区分脑外和脑内层，但在我们的工作中，fNIRS传感器的特定配置阻止了这一点。

我们只有有限数量的fNIRS传感器，无法以更好的横向分辨率绘制血流动力学响应图，例如区分大脑皮层的前部和后部。如果一个人有兴趣了解特定的机制和参与运动执行的所有不同的皮质区域，那么标测是很重要的。事实上，运动是一项涉及大脑多个区域的复杂任务43；关于大型食草动物运动皮层组织的综述和扩展参考文献，参见参考文献44。因此，在我们的工作中，当羊在运动时，大脑中的具体工作机制和多个大脑区域的反应尚无法详细研究，需要进一步研究。

我们通过使用均匀模型测量了绵羊头部的基线光学特性。我们使用的时间分辨漫反射光谱系统具有有限的响应性，这阻止了在足够短的总采集时间内采集多个离散波长的多距离测量值（正确应用两层模型所需），从而不会在被测动物中引起应力。改进基线光学特性的估计可以进一步改善血流动力学反应的量化。

同样，假设减少的散射系数在时间（实验期间）和空间（脑外和脑内体层）上是恒定的，可能会影响血流动力学响应的准确性。然而，在功能测试期间，减小的散射系数不太可能发生明显变化。

我们忽略了其他发色团（如水、脂质、拼贴）在估算（基线和瞬时）O2Hb和HHb浓度中的贡献。与减小的散射系数一样，我们不期望这些参数在功能测试期间发生显著变化。

在预处理阶段，基于对视频记录的视觉检查来去除块。去除伪影，特别是运动伪影的另一种更客观的方法是使用加速度计25。由于所使用的fNIRS设备没有内置加速度传感器，我们倾向于不在动物头部的有限空间上添加另一个传感器，从而使实验设置更加复杂。

最后，目前的工作并没有给出关于绵羊进行行为任务的大脑反应模式的明确结论。事实上，从一个或几个实验中很难获得清晰明确的大脑反应模式，这些实验需要重复试验或更大的动物样本。fNIRS技术仍然是研究自由活动动物皮层活动的创新方法，使用fNIRS对动物进行的研究数量仍然很少。

方法

道德声明

所有动物实验方法均按照相关指南和法规进行，所有实验方案均由指定的机构和/或许可委员会批准。特别是，该研究设计符合意大利动物实验立法，并获得了国家伦理委员会的批准（Ministero della Salute，Direzone Generale della SanitàAnimale e dei Farmaci Veterinari，Uffio 6，授权编号：◦457/2016-PR，919/2017-PR）。如果任何动物被认为处于轻度以上的压力（由独立兽医现场评估），那么它将立即从研究中移除。

动物、住房和畜牧业

13只8个月大的萨尔达羊从同一群中选出。所有的绵羊都没有怀孕或哺乳期，它们以前从未参与过任何研究。他们被安置在一个45平方米的围栏（休息箱）中，每天喂两次干草（上午8点和下午6点）。饮食中补充了商业浓缩物（Mangimi Ariston Srl，Teramo，意大利；250–300克/只羊）。所有的羊都可以自由饮水，并提供稻草作为被褥。

实验区域和行为任务

为了测量不同条件下的大脑活动，所有绵羊都进行了一项运动任务和一项令人吃惊的测试。实验区（图5）是绵羊熟悉的，它包括一条走廊（2米宽 × 20m长）和惊吓测试笔。走廊末端用通常用于建造动物围栏的金属板封闭（高度1.5米）。惊吓测试围栏与绵羊饲养时的围栏相似。为了避免在行为任务中与羊群隔离的任何负面影响，绵羊总是被分成小组饲养（3-5名受试者）。

图5

图5

实验区域（a）的示意图，虚线表示移动围栏，白线表示运动任务包括绵羊以相同的速度沿着走廊行走，并在被要求时停下。因此，每次都有五只羊在走廊里移动，并训练它们在30秒内缓慢而平静地行走，然后在接下来的30秒内停止行走。为此，它们通过经典的条件调节训练，根据声音提示开始和停止行走。培训每天进行，为期26天。我们逐渐习惯于让羊戴上假fNIRS探头，包括帽子、电缆和胸带，遵循以下方案：第1天到第7天，羊在没有任何探头的情况下行走；第8-14天，绵羊戴着探头的支撑面罩行走；第15-26天，绵羊戴着探针的支撑面罩和模拟探针压力的海绵行走。在训练阶段结束时，绵羊没有表现出压力的迹象。

令人震惊的测试是，在动物附近突然打开一把伞，能够引起恐惧反应。为了减少习惯对惊人刺激的影响，选择进行fNIRS测量的绵羊之前从未接触过这种刺激。

fNIRS数据记录和数据分析

为了准确测量每只绵羊在进行不同行为任务时氧合血红蛋白（[ΔO2Hb]）和脱氧血红蛋白（[△HHb]）的浓度变化，可穿戴CW fNIRS系统（OctaMon，Artinis Medical Systems，The Netherlands）在两个波长（751 nm和839 nm）下以10 Hz的采样率运行，并且配备有4个发射器（光源）和2个接收器（检测器）。该设备由制造商定制，以实现多距离采集。两个光源和一个探测器放置在每个半球上，距离ρ = 10 mm和ρ = 分别为30mm，如图6a所示。这种配置允许记录来自浅表组织（例如头皮和颅骨）和皮质组织的信号。在fNIRS记录过程中，将传感器应用于剃光的羊头上，并用定制的头帽固定到位，如图所示。6b。

图6

图6

（a） 羊头表面光学探头的配置：红星代表发射器，绿色圆圈代表接收器。（b） 配有fNIRS装置的绵羊。

全尺寸图像

所有绵羊的fNIRS记录在连续两天内完成（第一天运动任务，第二天惊人测试）。在运动任务中，我们为每只羊记录了10次重复（块），每次重复30秒的步行，然后休息30秒（动物静止）。对于这项令人吃惊的测试，我们为每只羊记录了5个区块，包括30秒的基线（羊静止），接着是雨伞打开（3秒），然后是60秒的恐惧反应。运动任务和惊人测试的所有环节都用摄像机（松下，HDC-SD99，松下，日本）拍摄，并与fNIRS记录同步。然后使用软件Solomon Coder（beta 11.01版）分析视频记录。22），以确定绵羊是否表现出可能干扰fNIRS记录的行为，例如摇头、奔跑和跳跃。对于惊吓测试，评估恐惧反应（刺激后是否有飞行和/或冻结反应）。所考虑行为的行为图见补充表ST2。

fNIRS数据通过Matlab2015a中的脚本进行分析（Matlab，The MathWorks Inc.，Natick，Massachusetts）。由Oxysoft软件（v3.0.95，Artinis Medical Systems，荷兰）提取的原始fNIRS数据是每个波长和每个通道的光密度（OD）。对于每个任务，选择每个块之前的最后5秒作为基线。然后通过从所有OD值中减去基线时期的平均OD来计算OD相对于基线的变化（即ΔOD）。

根据对同龄羊的解剖和MRI测量，头皮和大脑皮层之间的平均距离估计为 = 10 mm。鉴于此，我们假设（见补充章节S3）ρ的ΔOD数据 = 10mm（ΔODSHORT）是指仅在脑外组织（头皮、颅骨和脑脊液）中传播的光子。因此，使用Levenberg–Marquardt算法进行非线性迭代最小二乘最小化（Matlab中的lsqcurvefit函数），并假设上层（代表脑外组织）的减少散射系数等于基线值（μs′UP = μs0′），我们将ΔODSHORT数据拟合到同质模型45，以估计相对于上层基线的吸收变化（ΔμaUP）。然后将上层吸收系数的绝对值计算为μaUP = μa0 + ΔμaUP，通过将基线吸收系数μa0与ΔμaUP相加（关于μa0估计值的描述，请参见补充章节S2）。

接下来，我们使用ρ处记录的ΔOD = 30 mm（ΔODLONG）和光子迁移的两层模型46，以导出Δμ接下来，我们使用ρ处记录的ΔOD = 30 mm（ΔODLONG）和光子迁移的两层模型46，以导出ΔμaDOWN，即底层（代表脑组织）吸收系数的变化。在此步骤中，我们假设上层的厚度为先验信息 = 10mm）、上层的吸收系数（μaUP）和上层和底层的降低散射系数（μs′UP = μs向下 = μs0′）。然后将底层吸收系数的绝对值计算为μaDOWN = μa0 + Δμa下降。

最后，根据两个波长的μaUP和μaDOWN，利用从成年绵羊47的测量得出的消光系数，通过比尔定律计算了两个层中的[O2Hb]和[HB]：1.672 cm−1 mM−1（751 nm），0.824 cm−1 m M−2（839 nm），以及[O2Hb]:0.752 cm−1 mM M−1），1.084 cm−1 mmM−1。

结论

我们在这项研究中的目标是提高绵羊fNIRS测量的准确性和可靠性，以更好地理解在不同环境条件下无创评估自由活动动物大脑活动的潜力。我们的研究结果证实，多距离CW fNIRS可以无创地测量自由运动的绵羊大脑皮层的活动，并且使用短距离和长距离的源探测器，结合光子扩散的两层模型，可以有效地区分大脑外信号和皮层信号。总的来说，这些结果表明，利用当前的设置和探头放置，我们主要测量的是绵羊大脑的运动区域。需要进一步的研究来澄清fNIRS技术是否可以可靠地应用于测量参与处理情感状态反应的深层皮质区域。未来的工作还必须考虑影响测量准确性的可能因素，例如探头位置和与认知功能相对应的物种特定神经解剖位置。